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本制品为TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。我司分别提供冻干粉形式和储存液形式(20μM)的TRITC标记鬼笔环肽，用户根据自身需求选择。建议使用浓度为80～200 nM。

鬼笔环肽(Phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)的环状七肽毒素，以高亲和力(Kd= 20 nM)选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白(Actin)抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白(Actin)的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。

鬼笔环肽(Phalloidin)的结合阻止丝状肌动蛋白(微丝)的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度(CC)降至＜1μg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。

• 鬼笔环肽具有毒性，需小心操作(对人的半数致死剂量LD50约2mg/kg)。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• (可选)甲醇
  
• 1×PBS缓冲液，pH7.4，细胞培养级别
  
• 固定液4%多聚甲醛(溶于PBS缓冲液)
  
• 丙酮或透化液0.5% Triton X-100(溶于PBS缓冲液)
  
• 抗荧光淬灭封片剂(水溶性)(货号：SY0875)，DAPI(货号：SY0495)
  
• (可选)抗荧光淬灭封片剂(含DAPI，水溶性)(货号：SY0876)
  
• (可选)牛血清白蛋白(标准级别)(货号：SY0451)
  
• 载玻片和盖玻片
  
• 盖玻片周围密封液(如透明指甲油)
  
• 组装有TRITC激发/发射滤片，以及DAPI激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。

• 工作液准备
  
  • 对于TRITC标记鬼笔环肽TRITC标记鬼笔环肽(300T)
    本品以溶于甲醇的20μM储存液形式提供，总量为300μL。按照100 nM的工作液浓度来换算，可制备总量为60mL的工作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。
    开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80～200 nM。工作液现配现用。
    
  • 对于TRITC标记鬼笔环肽(1mg)
    本品以冻干粉形式提供，分子量为1231.4，总量为1mg。可先用甲醇或者DMSO充分溶解配制成20～100μM的储存液。如，加入8.1208mL甲醇到1mg鬼笔环肽即得到100μM等量的储存液，根据单次使用量，进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。
    开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80～200 nM。工作液现配现用。
• 染色步骤
  
  • 细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。
    
  • 吸掉培养液，37℃预热的1×PBS(pH7.4)清洗细胞2次。
    
  • 使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10min。
    注：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
    
  • 室温条件下，用PBS清洗细胞2～3次，每次10min。
    
  • 室温条件下，用丙酮(≤-20℃)脱水或者用0.5% Triton X-100溶液透化处理5min。
    
  • 室温条件下，用PBS清洗细胞2～3次，每次10min。
    
  • 取200μL配制好的TRITC标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min(通常情况下，4℃～37℃孵育皆可)。
    注：为了降低背景，可于TRITC标记的鬼笔环肽工作液内加入1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。
    
  • 用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。
    
  • 使用200μL DAPI溶液(浓度：100 nM)对细胞核进行复染，约30 s。
    
  • 用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluo-G水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做F-actin染色分析。
    注：也可以直接使用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂合并步骤9和10，简化步骤。
    
  • 荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择TRITC激发/发射滤片(Ex/Em=545/570nm)和DAPI激发/发射滤片(Ex/Em=364/454nm)。